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Der HPLC-Experte II: So nutze ich meine HPLC / UHPLC optimal!

Der HPLC-Experte II: So nutze ich meine HPLC / UHPLC optimal!

Stavros Kromidas

ISBN: 978-3-527-68778-7

May 2015

404 pages

$62.99

Description

Erstmalig in einem Buch liegt die moderne HPLC/UHPLC-Anlage im Fokus. In kompakter Form wird gezeigt, wie die verschiedenen Geräte für eine maximale Auflösung optimal genutzt werden können. Aber auch wie vorzugehen ist, wenn eher die Robustheit im Vordergrund steht. Praxisnah erfährt der erfahrene Leser welche Möglichkeiten ihm heute zur Verfügung stehen aber auch wo die Grenzen einer modernen HPLC/UHPLC-Anlage liegen. Ein Handbuch von Praktikern für Praktiker.

Teil 1

• Wann sollte ich meine UHPLC als UHPLC betreiben?

• Die moderne HPLC/UHPLC-Anlage

• Die Anforderungen heute an die einzelne Module

• Der Säulenthermostat – eine einfache Angelegenheit?

• Das Problem der Bandenverbreiterung in einer HPLC/UHPLC-Anlage

• Der Gradient; Anforderungen, optimaler Einsatz, Tricks und Fallstricke

• Anforderungen an LC-Hardware bei der Kopplung mit unterschiedlichen Massenspektrometern

• 2D-Chromatographie – Möglichkeiten und Grenzen

• Materialien in HPLC/UHPLC – was, für welchen Zweck?

Teil 2

• Was muss die Software können, damit die Hardware optimal genutzt werden kann?

• Aspekte der modernen HPLC - Erfahrungsbericht eines Anwenders

• Erfahrungsbericht eines unabhängiges Serviceingenieurs – Tipps und

• Empfehlungen für einen optimalen Betrieb von Agilent- und Waters-Anlagen Der Analyt, die

• Fragenstellung und die UHPLC – der Einsatz von UHPLC in der Praxis

• Geräte-Hersteller berichten - Beiträge von Agilent, Shimadzu und Thermo Scientific

Vorwort XIII

ZumAufbau des Buches XV

Beitragsautoren XVII

1 Wann sollte ichmeine UHPLC als UHPLC betreiben? 1
S. Kromidas

1.1 Was möchte ich erreichen und was „kann“ die UHPLC? 1

1.2 Anforderungen an eine HPLC-Methode 3

1.2.1 Gut trennen 3

1.2.2 Schnell trennen 13

1.2.3 Massenempfindlichkeit verbessern (konstantes Injektionsvolumen) 15

1.2.4 Robuste Trennungen gewährleisten 17

1.3 Die UHPLC im Alltag 19

1.4 Wie kann das Potenzial der UHPLC tatsächlich ausgeschöpft werden? 23

1.5 Zusammenfassung und Ausblick 26

Literatur 29

Teil 1 Hardware/Software Spezifika, Trennmodi, Materialien 31

2 Die moderne HPLC-/UHPLC-Anlage 33

2.1 Heutige Anforderungen an die einzelnen Module 33
S.Wiese

2.1.1 Überblick 33

2.1.2 UHPLC-Pumpentechnik 34

2.1.3 Autosampler 41

2.1.4 Säulenofen 47

2.1.5 Detektoren 50

2.1.6 Kapillaren/Verschraubungen 53

Literatur 57

2.2 Der Säulenofen – eine einfache Angelegenheit? 59
M. Heidorn und F. Steiner

2.2.1 Thermische Betriebsweisen von Säulenöfen 62

2.2.2 Temperaturunterschiede zwischenmobiler Phase undLC-Säule 64

2.2.3 Reibungswärme – nur ein Phänomen der UHPLC? 69

2.2.4 Thermostatisierung in der Methodenübertragung 76

Literatur 79

3 Das Problem der externen Bandenverbreiterung in einer HPLC-/UHPLC-Anlage 81
M. Dittmann

3.1 Theoretischer Hintergrund 83

3.1.1 Effizienz und Peakauflösungmoderner UHPLC-Säulen 83

3.1.2 Bestimmung der Peakvolumina 85

3.2 Externe Bandenverbreiterung in UHPLC-Systemen 87

3.2.1 Die Ursachen externer Bandenverbreiterung in HPLC-/UHPLC-Systemen 87

3.2.2 Experimentelle Bestimmung der externenBandenverbreiterung 97

3.3 Auswirkung externer Bandenverbreiterung in verschiedenen Applikationsbereichen 100

3.3.1 Einfluss auf isokratische Trennungen 100

3.3.2 Auswirkungen auf Gradiententrennungen 100

3.4 Optimierung des HPLC-/UHPLC-Systems 104

3.4.1 Test der Säuleneffizienz 105

3.4.2 Andere isokratische Trennungen 105

3.4.3 Hochauflösende Gradiententrennungen 106

3.4.4 Schnelle Gradiententrennungen 106

3.5 Zusammenfassung 107

Literatur 108

4 Der Gradient – Anforderungen, optimaler Einsatz, Tricks und Fallstricke 111
F. Steiner und M. Heidorn

4.1 Apparative Einflüsse bei der Gradientenelution– einÜberblick 111

4.1.1 Gradientenverweilvolumen oder Gradientenverzögerungsvolumen 111

4.1.2 Rolle des Gradientenmischers 113

4.1.3 Auf physikalisch-chemischen Phänomenen beruhendeUnterschiede zwischen Gradientenpumpentypen 115

4.1.4 Apparative Einflüsse außerhalb der Pumpe 121

4.1.5 Belastung undAbnutzung von Säulen bei Gradientenmethoden 124

4.2 Technische Umsetzung und Charakterisierung von Gradienten-HPLC 125

4.2.1 Wissenswertes und Grundlegendes zum Einfluss der bei Gradientenpumpen angewandten Förderund Dosierungstechniken 126

4.2.2 Notwendigkeit der Entgasung der Laufmittelkomponenten 128

4.2.3 Verschiedene Pumpentypen (seriell, parallel, Nockenantrieb, Spindelantrieb) und ihre Spezifika 130

4.2.4 Auswirkungen der Pumpenbauart auf die Anwendung im Gradienten 134

4.2.5 Auswirkungen der Arbeitszyklen auf die Chromatographie und notwendige Abstimmungen bei HPG-Anlagen 135

4.2.6 Auswirkungen der Arbeitszyklen auf die Chromatographie und notwendige Abstimmungen bei LPG-Anlagen – eine gänzlich verschiedene Problematik 139

4.2.7 Thermische Effekte in einer Gradientenpumpe und ihre Auswirkungen 141

4.2.8 Methoden mit besonders steilen (ballistischen) Gradienten 142

4.2.9 Grundsätzliches zurBestimmung desGradientenverweilvolumens einer Apparatur 149

4.2.10 Die Markerpulsmethode als eine quick-and-dirty Lösung 150

4.2.11 Die Dolan-Methode – ein Klassiker und seine Varianten 152

4.2.12 Wie eine effektive Mischung bei einem angemessenen GDV technisch erreicht werden kann 154

4.2.13 Charakterisierung der Mischungseffizienz undGradientenformung einer Apparatur 160

4.2.14 RichtigesMischervolumen in Abhängigkeit von Pumpentyp, Flussrate und Applikation amBeispiel von TFA-Gradienten 166

4.2.15 Gradientenmischung und die Besonderheiten bei der Elution von Proteinen 173

Literatur 174

5 Anforderungen bei der (U)HPLC-Kopplung mit unterschiedlichen Massenspektrometern 175
T. Teutenberg, T. Hetzel, C. Portner und J. Türk

5.1 Einleitung 175

5.2 Von der Target-Analytik zu Screeninguntersuchungen 176

5.2.1 Target-Analytik 176

5.2.2 Suspected-Target Screening 176

5.2.3 Non-Target Screening 177

5.3 Was ist bei der Kopplung von UHPLC undMS zu beachten? 178

5.3.1 Das Interface und die optimale Flussrate 178

5.3.2 Optimierung der massenspektrometrischen Parameter 179

5.3.3 Optimierung der chromatographischen Parameter 179

5.3.4 Auswahl der geeigneten Säule und Säulengeometrie 181

5.4 Target-AnalytikmittelsTriple-Quadrupol-Massenspektrometrie 184

5.5 Screening mittels LC-MS 192

5.6 Miniaturisierung – LC-MS quo vadis? 197

Literatur 201

6 2D-Chromatographie – Möglichkeiten und Grenzen 203
T. Teutenberg

6.1 Einführung – warum zweidimensionale HPLC? 203

6.2 Peakkapazität ein- und zweidimensionalerHPLC-Verfahren 205

6.2.1 Peakkapazität eindimensionaler Trennverfahren 205

6.2.2 Peakkapazität zweidimensionaler Trennverfahren 206

6.3 Modulation 210

6.3.1 Online Heart-Cut 2D LC 210

6.3.2 Umfassende Online 2D LC 211

6.3.3 Stop-Flow und Offline LC× LC 213

6.4 Praktische Probleme der online LC× LC 214

6.4.1 Kompatibilität der Lösemittelsysteme 214

6.4.2 Verdünnung 214

6.4.3 Hohe Flussraten 214

6.4.4 Kompatibilität mit Massenspektrometrie 215

6.5 Realisierung eines miniaturisierten LC × LC-Systemaufbaus 215

6.5.1 Technische Plattform 215

6.5.2 Auswahl der stationären Phasen 216

6.5.3 Auswahl der mobilen Phase und Temperatur 217

6.5.4 Säulengeometrie und Modulation 217

6.5.5 Gradientenprogrammierung und Gesamtanalysenzeit 218

6.5.6 Kopplung mit Massenspektrometer 218

6.6 Applikationsbeispiel 219

6.6.1 Messung eines Referenzstandards 219

6.6.2 Messung einer Realprobe 221

6.7 Vorteile derMS/MS-Funktionalität 222

6.8 Offline LC ×LC versus Online LC× LC 223

6.9 Lösungen derGerätehersteller (in alphabetischer Reihenfolge) 226

6.9.1 Kommerziell verfügbare Gesamtlösungen für die LC ×LC 227

6.9.2 Weitere Systemlösungen 228

6.10 2D-LC – quo vadis? 228

6.10.1 Software 228

6.10.2 Systemkonfektionierung 229

6.10.3 Peakkapazität versus Realprobe 229

6.11 Abschließende Bemerkungen 230

Literatur 231

7 Materialien in HPLC und UHPLC – was für welchen Zweck? 233
Tobias Fehrenbach und Steffen Wiese

7.1 Abkürzungsverzeichnis 233

7.2 Überblick 234

7.3 Anforderungen an Materialien einer UHPLC 235

7.3.1 Mechanische Beständigkeit 236

7.3.2 Chemische Beständigkeit 236

7.3.3 Kompatibilität zum Analyten/Biokompatibilität 237

7.4 Flusswege in einem UHPLC-System 238

7.4.1 Niederdruck- und Hochdruckflussweg 238

7.4.2 Flussweg der mobilen Phase und der Probe 239

7.5 Niederdruckflussweg 240

7.6 Hochdruckflussweg 242

7.6.1 Pumpe 242

7.6.2 Autosampler 249

7.6.3 Kapillaren und Verschraubungen 255

7.7 Wann und warum kann ein inertes UHPLC-System erforderlich sein? 260

7.7.1 Begriff der Inertheit 261

7.7.2 Natur der Passivschicht 262

7.7.3 Anforderungen undWechselwirkungen 266

7.7.4 Passivierungsstrategien und -methoden 272

Literatur 275

Teil 2 Erfahrungsberichte, Trends 281

8 Wasmuss die Software können,damitdieHardwareoptimalgenutzt werden kann? 283
A. Simon

8.1 Einführung 283

8.2 Funktionalität und Bedienung 284

8.3 Integration 284

8.4 Gerätesteuerung 285

8.5 Bedienung 286

8.6 Ease of Use 287

8.7 Bedienoberflächen 288

8.8 Multilingual 289

8.9 Austausch von Daten 290

8.10 Datenimport und -export 291

8.11 Skalierbarkeit vom PC bis zur globalen Installation 292

9 Aspekte dermodernenHPLC– ErfahrungsberichteinesAnwenders 295
Steffen Wiese

9.1 Einführung 295

9.2 Bestimmung des Gradientenverweilvolumens 295

9.3 Hochdurchsatztrennung (High Throughput Separations) 299

9.4 Methodentransfer zwischen UHPLC-Systemen unterschiedlicher Hersteller 302

9.5 Anwendung höherer Temperaturen 305

9.6 Injektion großer Volumina (Large Volume Injection, LVI) 307

9.7 UHPLC-Trennungen mit 1mm Innendurchmesser Säulen 312

Literatur 315

10 Erfahrungsbericht eines unabhängigen Serviceingenieurs – Tipps und Empfehlungen für einen optimalen Betrieb von Agilent- und Waters-Anlagen im Alltag 317
S. Chroustovsky

10.1 Einleitung 317

10.2 Der Degasser, Prinzipien 317

10.2.1 Verschiedene Hersteller, verschiedene Typen 318

10.3 Die Pumpe, Prinzipien 319

10.3.1 Verschiedene Hersteller, verschiedene Typen 321

10.4 Autosampler, Prinzipien 322

10.4.1 Verschiedene Hersteller, verschiedene Typen 324

10.5 Die UV-Detektoren, Prinzipien 325

10.5.1 Verschiedene Hersteller, verschiedene Typen 326

11 Der Analyt, die Fragestellung und die UHPLC – der Einsatz von UHPLC in der Praxis 329
S. Lamotte

11.1 Einleitung 329

11.2 Wann ist der Einsatz vonUHPLCsinnvoll undwann eher nicht? 329

11.3 Freisetzungstests in der pharmazeutischen Industrie 331

11.4 Methodenentwicklung und -optimierung 331

11.5 Klassische flüssigchromatographische Analytik 332

11.6 Schnelle (meist zweite) Dimension der multidimensionalen Chromatographie 332

11.7 Trennung von (Bio)polymeren 333

11.8 Prozessanalysentechnik (PAT) 334

Literatur 334

12 Gerätehersteller berichten 335

12.1 Agilent Technologies,Waldbronn 335
J. Trafkowski

Literatur 345

12.2 Shimadzu, Duisburg 346
B.-T. Erxleben

12.3 Thermo Fisher Scientific, Germering 352
F. Steiner

12.3.1 Anforderungen an das gesamte System und wie die Erfahrung gelehrt hat diese zu meistern 352

12.3.2 Die Eluentenförderungseinheit, weit mehr als eine Hochdruckpumpe 357

12.3.3 Der Probengeber für das robusteAusführen ultrapräziser Analysen, auch im Hochdurchsatz 358

12.3.4 NeueWege der Säulenthermostatisierung für die besteTrennleistung undMethodenübertragbarkeit 360

12.3.5 Auch eine exzellente ultraschnelle Trennung muss von einem Detektor aufgezeichnet werden 361

12.3.6 2D-LC zur Steigerung der Peakkapazität und andere Wege zu diesem Ziel sowie zur Steigerung der Produktivität 364

Über die Autoren 367

Index 371