Skip to main content

Elektrophorese leicht gemacht: Ein Praxisbuch für Anwender, 2. Auflage

Elektrophorese leicht gemacht: Ein Praxisbuch für Anwender, 2. Auflage

Reiner Westermeier

ISBN: 978-3-527-80849-6

Sep 2016

474 pages

Geleitwort XV

Vorwort XVII

Vorwort zur ersten Auflage XIX

Abkürzungen XXI

Teil I Grundlagen 1

1 Elektrophorese 7

1.1 Allgemeines 7

1.1.1 Elektrophoresen in freier Lösung 7

1.1.2 Elektrophoresen in stabilisierenden Medien 11

1.1.3 Gelelektrophorese 12

1.1.4 Stromversorger 20

1.1.5 Trennkammern 20

1.2 Elektrophoresen in nicht restriktiven Gelen 25

1.2.1 Agarosegelelektrophorese 25

1.2.2 Polyacrylamidgelelektrophorese von niedermolekularen Substanzen 27

1.3 Elektrophorese in restriktiven Gelen 28

1.3.1 Der Ferguson-Plot 28

1.3.2 Agarosegelelektrophorese 29

1.3.3 Polyacrylamidgelelektrophorese von Nukleinsäuren 31

1.3.4 Polyacrylamidgelelektrophorese von Proteinen 34

Literatur 48

2 Isotachophorese 53

2.1 Wanderung mit gleicher Geschwindigkeit 55

2.2 Trennung der Substanzen in der Form einer Kette ion train 55

2.3 Zonenschärfungseffekt 55

2.4 Konzentrationsregulierungseffekt 56

Literatur 57

3 Isoelektrische Fokussierung 59

3.1 Prinzip 59

3.2 Gele für die IEF 61

3.2.1 Polyacrylamidgele 61

3.2.2 Agarosegele 63

3.3 Temperatur 64

3.4 Kontrolle des pH-Gradienten 64

3.5 Arten von pH-Gradienten 65

3.5.1 Freie Trägerampholyten 65

3.5.2 Immobilisierte pH-Gradienten 69

3.6 Präparative Isoelektrische Fokussierung 72

3.7 Titrationskurvenanalyse 73

Literatur 75

4 Hochauflösende Zweidimensional-Elektrophorese 79

4.1 IEF in IPG-Streifen 79

4.1.1 Streifengeometrie 80

4.1.2 pH-Gradienten 80

4.1.3 Einfluss von Salzen 80

4.1.4 Basische pH-Gradienten 81

4.1.5 Rehydratisieren von IPG-Streifen 82

4.1.6 Probenaufgabe 85

4.1.7 IEF-Bedingungen 87

4.1.8 Instrumentierung 88

4.2 SDS-PAGE 90

4.2.1 Äquilibrieren der IPG-Streifen 90

4.2.2 TechnischeKonzepte für die zweite Dimension (SDS-PAGE) 91

4.2.3 Geltypen 93

4.2.4 Gelherstellung 94

4.2.5 Durchführung der SDS-Elektrophorese 97

4.3 Proteomik 99

Literatur 99

5 Proteinprobenvorbereitung 103

5.1 Proteinquantifizierungsmethoden 103

5.2 Vorbereitung von nativen Proben 104

5.3 Proben für die SDS-Elektrophorese 105

5.3.1 SDS-Behandlung 105

5.3.2 Aufreinigung und Proteinanreicherung 109

5.4 Proben für die hochauflösende 2-D-PAGE 110

5.4.1 Waschen von Zellen 111

5.4.2 Zellaufschluss 111

Inhaltsverzeichnis VII

5.4.3 Probennahme und -aufbewahrung 112

5.4.4 Inaktivierung von Proteasen 114

5.4.5 Inaktivierung von Phosphatasen 114

5.4.6 Alkalische Bedingungen 114

5.4.7 Entfernung von störenden Substanzen 115

5.4.8 Vorfraktionierung 116

5.4.9 Spezialfall: Pflanzenproteine 117

Literatur 118

6 Proteindetektion 121

6.1 Fixierung 121

6.1.1 IEF-Gele 121

6.1.2 Agarosegele 122

6.1.3 SDS-Polyacrylamidgele 122

6.2 Färbungen nach der Elektrophorese 122

6.2.1 Organische Farbstoffe 122

6.2.2 Silberfärbung 123

6.2.3 Negativfärbung 125

6.2.4 Fluoreszenzfärbung 126

6.2.5 Spezifische Detektion 127

6.2.6 Visualisierung ohne Färbung 128

6.3 Proteinmarkierung 129

6.3.1 Proteinmarkierung mit Fluorophoren 129

6.3.2 Radioaktive Markierung von lebenden Zellen 130

6.4 Differenzgelelektrophorese (DIGE) 130

6.4.1 Minimal-Lysinmarkierung 131

6.4.2 Sättigung-Cysteinmarkierung 133

6.4.3 Der interne Standard 134

6.4.4 Planung eines Experiments 134

6.4.5 Die wichtigsten Vorteile von 2-D-DIGE 134

6.4.6 Vergleichende Fluoreszenzgelelektrophorese 135

6.5 Bildaufzeichnung, Bildanalyse, Spotpicken 136

6.5.1 Gehaltsbestimmungen 136

6.5.2 Bildaufzeichnungssysteme 138

6.5.3 Bildanalyse 141

6.5.4 Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen 144

Literatur 146

7 Blotting 151

7.1 Transfermethoden 151

7.1.1 Diffusions-Blotting 151

7.1.2 Kapillar-Blotting 152

7.1.3 Press-Blotting 153

7.1.4 Vakuum-Blotting 153

7.1.5 Elektrophoretisches Blotting 154

7.2 Blotmembranen 157

7.3 Puffer für elektrophoretische Transfers 158

7.3.1 Proteine 158

7.3.2 Nukleinsäuren 160

7.4 Allgemeine Anfärbung 160

7.5 Blockieren 161

7.6 Spezialdetektion 161

7.6.1 Hybridisierung 161

7.6.2 Enzym-Blotting 162

7.6.3 Immun-Blotting 162

7.6.4 Lektin-Blotting 165

7.6.5 Stripping,Mehrfachanalyse 166

7.6.6 Doppel-Blotting 166

7.7 Proteinsequenzierung 166

7.8 Transferprobleme 166

7.9 Elektroelution von Proteinen aus Gelen 167

Literatur 169

Teil II Praktische Methodenanleitungen – Ausrüstung und Methoden 173

Methode 1 PAGE von Farbstoffen 183

M1.1 Probenvorbereitung 183

M1.2 Stammlösungen 183

M1.3 Vorbereitung der Gießkassette 184

M1.3.1 Dichtung 184

M1.3.2 Slotformer 184

M1.3.3 Zusammenbau der Gießkassette 185

M1.4 Gießen der ultradünnen Gele 187

M1.5 Elektrophoretische Trennung 187

M1.5.1 Entnahme des Gels aus der Kassette 187

Methode 2 Agarose- und Immunelektrophoresen 191

M2.1 Probenvorbereitung 191

M2.2 Stammlösungen 192

M2.3 Herstellung der Gele 192

M2.3.1 Agarosegelelektrophorese 192

M2.3.2 Immunelektrophoresegele 194

M2.4 Elektrophoresen 198

M2.4.1 Grabar-Williams-Technik 199

M2.4.2 Laurell-Technik 199

M2.5 Proteinnachweis 200

M2.5.1 Coomassie-Färbung (Agaroseelektrophorese) 200

M2.5.2 Immunfixation der Agaroseelektrophorese 200

M2.5.3 Coomassie-Färbung (Immunelektrophoresen) 201

M2.5.4 Silberfärbung 202

Literatur 202

Methode 3 Titrationskurvenanalyse 203

M3.1 Probenvorbereitung 203

M3.2 Stammlösungen 203

M3.3 Herstellung der leeren Gele 204

M3.3.1 Vorbereitung der Gießform 204

M3.3.2 Zusammenbau der Gelkassette 205

M3.3.3 Befüllen der Gelgießkassette 207

M3.3.4 Entnahme des Gels aus der Gießkassette 207

M3.4 Titrationskurvenelektrophorese 209

M3.4.1 Erzeugung des pH-Gradienten (Lauf ohne Probe) 209

M3.4.2 Nativelektrophorese im pH-Spektrum 210

M3.5 Coomassie- und Silberfärbung 210

M3.5.1 Kolloidale Coomassie-Färbung 210

M3.5.2 Acid-Violet-17-Färbung 211

M3.5.3 Fünf-Minuten-Silberfärbung getrockneter Gele 211

M3.6 Interpretation der Kurven 212

Literatur 214

Methode 4 Native PAGE in amphoteren Puffern 215

M4.1 Probenvorbereitung 216

M4.2 Stammlösungen 217

M4.3 Herstellung der leeren Gele 218

M4.3.1 Slotformer 218

M4.3.2 Zusammenbau der Gießkassette 219

M4.3.3 Polymerisationslösungen 220

M4.3.4 Befüllen der gekühlten Gelgießkassette 221

M4.3.5 Entnahme des Gels aus der Gießkassette 221

M4.3.6 Waschen und Trocknen der Gele 222

M4.3.7 Quellen des Gels im amphoteren Puffer 222

M4.4 Elektrophorese 224

M4.5 Coomassie- und Silberfärbung 226

M4.5.1 Kolloidale Coomassie-Färbung 226

M4.5.2 Acid-Violet-17-Färbung 227

M4.5.3 Fünf-Minuten Silberfärbung getrockneter Gele 227

Literatur 228

Methode 5 Agarosegel-IEF 231

M5.1 Probenvorbereitung 231

M5.2 Herstellung des Agarosegels 232

M5.2.1 Hydrophobisierung des Abstandhalters 232

M5.2.2 Zusammenbau der Gelkassette 232

M5.2.3 Herstellung der Agaroselösung (0,8% Agarose) 233

M5.3 Isoelektrische Fokussierung 235

M5.3.1 Herstellung der Elektrodenlösungen 235

M5.4 Proteinnachweis 237

M5.4.1 Coomassie-Blau-Färbung 237

M5.4.2 Immunfixation 237

M5.4.3 Silberfärbung 238

Literatur 239

Methode 6 PAGIEF in rehydratisierten Gelen 241

M6.1 Probenvorbereitung 241

M6.2 Stammlösungen 241

M6.3 Herstellung der leeren Gele 242

M6.3.1 Hydrophobisierung des Abstandhalters 242

M6.3.2 Zusammenbau der Gelkassette 242

M6.3.3 Befüllen der Gelgießkassette 243

M6.3.4 Entnahme des Gels aus der Gießkassette 244

M6.3.5 Waschen des Gels 244

M6.3.6 Trocknen des Gels 245

M6.4 Isoelektrische Fokussierung 245

M6.4.1 Rehydratisierlösung (Servalyt™, Pharmalyte™) 245

M6.4.2 Quellen des Gels 245

M6.4.3 Proteintrennung 246

M6.4.4 Probenaufgabe 247

M6.5 Coomassie- und Silberfärbung 248

M6.5.1 Kolloidale Coomassie-Färbung 248

M6.5.2 Acid-Violet-17-Färbung 249

M6.5.3 Die empfindlichste Silberfärbung für die IEF 249

M6.6 Methodischer Ausblick 251

Literatur 253

Methode 7 Horizontale SDS-Polyacrylamidelektrophorese 255

M7.1 Probenvorbereitung 255

M7.1.1 Nicht reduzierende SDS-Behandlung 255

M7.1.2 Reduzierende SDS-Behandlung 256

M7.1.3 Reduzierende SDS-Behandlungmit Alkylierung 257

M7.2 Proteinmarkierung mit einem Fluoreszenzfarbstoff 257

M7.2.1 Markierung 257

M7.2.2 Detektion 258

M7.3 Stammlösungen für die Gelherstellung 258

M7.4 Vorbereitung der Gießkassette 259

M7.4.1 Herstellen des Slotformers 259

M7.4.2 Zusammenbau der Gießkassette 260

M7.5 Gradienten-Gel 261

M7.5.1 Gießen des Gradientengels 261

M7.6 Elektrophorese 265

M7.6.1 Vorbereitung der Trennkammer 265

M7.6.2 Entnahme des Gels aus der Kassette 265

M7.6.3 Platzierung auf der Kühlplatte 265

M7.6.4 Elektrophorese 267

M7.7 Coomassie- und Silberfärbung 267

M7.7.1 Heiße Coomassie-Färbung 267

M7.7.2 Kolloidalfärbung 268

M7.7.3 Reversible Imidazol-Zink-Negativfärbung 269

M7.7.4 Silberfärbung 270

M7.7.5 Fluoreszenzfärbung mit SERVA Purple 270

M7.8 Blotting 271

M7.9 Methodischer Ausblick 272

M7.9.1 SDS-Elektrophorese in gewaschenen und rehydratisierten Gelen 272

M7.9.2 Trennung von Peptiden 273

Literatur 274

Methode 8 Vertikale PAGE 275

M8.1 Probenvorbereitung und Proteinmarkierung 276

M8.2 Stammlösungen für die SDS-PAGE 277

M8.3 Gießen von Einzelgelen 278

M8.3.1 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgele 278

M8.3.2 Gradientengele 279

M8.4 Gießen vonMehrfachgelen 281

M8.4.1 Multiple diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgele 282

M8.4.2 Multiple SDS-Polyacrylamidgradientengele 283

M8.5 Elektrophorese 286

M8.6 SDS-Elektrophorese von niedermolekularen Peptiden 288

M8.6.1 Stammlösungen 288

M8.7 Zweidimensional-Elektrophorese 289

M8.8 DNA-Elektrophorese 290

M8.9 Langzeitstabile Gele 291

M8.10 Proteindetektion 291

M8.11 Präparieren von Glasplatten mit Bind-Silan 292

M8.11.1 Beschichten einer Glasplatte mit Bind-Silan 292

M8.11.2 Entfernen von Gel und Bind-Silan von einer Glasplatte 293

Literatur 293

Methode 9 Blau-Nativ-PAGE 295

M9.1 Solubilisierung 295

M9.2 Stammlösungen 296

M9.3 Gießen der Gele 297

M9.4 Elektrophorese 299

Literatur 300

Methode 10 Semidry-Blotting von Proteinen 301

M10.1 Transferpuffer 303

M10.1.1 Kontinuierliches Puffersystem 303

M10.1.2 Diskontinuierliches Puffersystem 303

M10.1.3 Transfers aus Agarosegelen 304

M10.2 Technische Durchführung 304

M10.2.1 Gele ohne Trägerfolie 305

M10.2.2 Trägerfoliengebundene Gele 306

M10.2.3 Bei Verwendung von Nitrocellulose (NC)-Membran 306

M10.2.4 Bei Verwendung einer PVDF-Membran 307

M10.2.5 Proteintransfer aus den abgeschnittenen Gelen 308

M10.3 Färbung von Blotfolien 309

M10.3.1 Amidoschwarzfärbung 309

M10.3.2 Reversible Färbung 309

M10.3.3 Indian-Ink-Färbung 310

Literatur 311

Methode 11 IEF im immobilisierten pH-Gradienten 313

M11.1 Probenvorbereitung 314

M11.2 Stammlösungen 314

M11.3 Immobilinerezepturen 315

M11.3.1 Maßgeschneiderte pH-Gradienten 315

M11.4 Vorbereitung der Gießkassette 318

M11.4.1 Hydrophobisierung des Abstandhalters 318

M11.4.2 Zusammenbau der Gelkassette 319

M11.5 Herstellung der pH-Gradientengele 320

M11.5.1 Gießen des Gradienten 321

M11.6 Isoelektrische Fokussierung 327

M11.6.1 Probenaufgabe 327

M11.6.2 Elektrodenlösungen 328

M11.6.3 Fokussierungsbedingungen 328

M11.6.4 Messung des pH-Gradienten 329

M11.7 Coomassie- und Silberfärbung 329

M11.7.1 Kolloidale Coomassie-Färbung 329

M11.7.2 Acid-Violet-17-Färbung 330

M11.8 Strategien der IPG-Fokussierung 331

Literatur 332

Methode 12 Hochauflösende Zweidimensional-Elektrophorese 333

M12.1 Probenvorbereitung 334

M12.1.1 Probenaufreinigung 335

M12.1.2 Wichtige Hinweise zur kompletten Resolubilisierung der Pellets 335

M12.2 Proteinmarkierung mit einem Fluoreszenzfarbstoff 338

M12.2.1 Markierung einer Probe 338

M12.2.2 Detektion 338

M12.3 Stammlösungen für die Gelherstellung 339

M12.4 Gelherstellung 340

M12.4.1 IPG-Streifen 340

M12.5 SDS-Porengradientengele 344

M12.6 Trennbedingungen 346

M12.6.1 Erste Dimension (IPG-IEF) 346

M12.6.2 Äquilibrieren 351

M12.6.3 Zweite Dimension (SDS-Elektrophorese) 352

M12.7 Proteindetektion 356

M12.7.1 Färben von multiplen Gelen 356

M12.7.2 Kolloidalfärbung 358

M12.7.3 Reversible Imidazol-Zink-Negativfärbung 358

M12.7.4 Silberfärbung 359

M12.7.5 Fluoreszenzfärbung mit SERVA Purple 360

Literatur 361

Methode 13 Zweidimensional-Differenzgelelektrophorese (DIGE) 365

M13.1 Planung eines Experiments 365

M13.2 Probenvorbereitung 366

M13.2.1 Solubilisierung von DIGE-Proben 366

M13.2.2 Rekonstituierung der CyDyes 367

M13.2.3 Für Minimalmarkierung der Lysine 367

M13.2.4 Für Sättigungsmarkierung der Cysteine 368

M13.3 DIGE-Markierung 368

M13.3.1 Minimalmarkierung der Lysine 368

M13.3.2 Sättigungsmarkierung der Cysteine 369

M13.4 Vorbereitung für die Probenaufgabe auf die IPG-Streifen 371

M13.5 Detektion der DIGE-Spots 371

Literatur 372

Methode 14 PAGE von DNA-Fragmenten 373

M14.1 Stammlösungen 374

M14.1.1 Puffersystem I (Tris-Acetat/Tris-Tricin) 374

M14.1.2 Puffersystem II (Tris-Phosphat/TBE) 375

M14.2 Herstellung der Gele 375

M14.2.1 Vorbereitung der Gießkassette 375

M14.2.2 Herstellen des Slotformers 376

M14.2.3 Zusammenbau der Gießkassette 377

M14.2.4 Befüllen der Gelgießkassetten 378

M14.2.5 Entnahme des Gels aus der Gießkassette 379

M14.2.6 Waschen und Trocknen der Gele 379

M14.3 Probenvorbereitung 379

M14.3.1 PCR-Produkte generell 379

M14.3.2 SSCP-Proben 380

M14.4 Elektrophorese 381

M14.4.1 Anquellen von gewaschenen und getrockneten Gelen 381

M14.4.2 Vorbereitung der Elektrodendochte 383

M14.4.3 Entnahme des Gels aus der Kassette 383

M14.4.4 Platzierung auf der Kühlplatte 384

M14.4.5 Probenaufgabe und Elektrophorese 385

M14.5 Silberfärbung 386

Anhang A Problemlösungen 389

A.1 Häufige Fehler 389

A.2 Isoelektrische Fokussierung 392

A.2.1 PAGIEF mit Trägerampholyten 392

A.2.2 Agarosegel-IEF mit Trägerampholyten 401

A.2.3 Immobilisierte pH-Gradienten 406

A.3 SDS-Elektrophorese 413

A.3.1 Horizontale SDS PAGE 413

A.3.2 Vertikale PAGE 422

A.4 Zweidimensional-Elektrophorese 425

A.5 Semidry-Blotting 433

A.6 PAGE von DNA-Fragmenten 440

Literatur 443

Stichwortverzeichnis 445